Ограничение сна, приводящее к недосыпанию, является распространенным явлением в современном обществе, работающем в режиме 24 часа в сутки, и связано с развитием проблем со здоровьем, включая сердечно-сосудистые заболевания. Нашей целью было изучить иммунологические эффекты длительного ограничения сна и последующего восстановительного сна путем моделирования рабочей недели и выходных, следующих за восстановительными, в лабораторных условиях.
Методы и результаты
После двух исходных 8-часовых ночей, проведенных в постели (TIB), 13 здоровых молодых мужчин спали только по 4 часа в сутки в течение 5 ночей, а затем 2 восстановительные ночи по 8 часов в сутки. 6 контрольных испытуемых спали по 8 часов в сутки на протяжении всего эксперимента. Частоту сердечных сокращений, артериальное давление, уровень кортизола в слюне и сывороточного С-реактивного белка (СРБ) измеряли после исходного уровня (BL), периода ограничения сна (SR) и периода восстановления (REC). В указанные моменты времени собирали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), подсчитывали их количество и стимулировали с помощью PHA. Пролиферацию клеток анализировали с помощью введения тимидина, а продукцию цитокинов - с помощью ИФА и ОТ-ПЦР. Уровень СРБ был повышен после SR (145% от BL; p<0,05) и продолжал повышаться после REC (231% от BL; p<0,05). Частота сердечных сокращений была увеличена после повторения (108% от нормы; р<0,05). Количество циркулирующих NK-клеток уменьшилось (65% от BL; p<0,005), а количество В-клеток увеличилось (121% от BL; p<0,005) после SR, но количество этих клеток почти полностью восстановилось во время REC. Пролиферация стимулированных PBMC увеличивалась после SR (233% от BL; p<0,05), что сопровождалось увеличением продукции IL-1β (137% от BL; p<0,05), IL-6 (163% от BL; p<0,05) и IL-17 (138% от BL; p<0,05) на уровне мРНК. После повторного введения уровень белка IL-17 все еще был повышен (119% от BL; p<0,05).
Выводы
5 ночей ограничения сна увеличивали активацию лимфоцитов и выработку провоспалительных цитокинов, включая IL-1β, IL-6 и IL-17; они оставались повышенными после 2 ночей восстановительного сна, что сопровождалось увеличением частоты сердечных сокращений и уровня СРБ в сыворотке крови, что является двумя важными факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. Таким образом, длительное ограничение сна может привести к стойким изменениям в иммунной системе, а повышенная выработка IL-17 в сочетании с СРБ может увеличить риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Вступление
Сон, как правило, считается восстановительным процессом, благотворно влияющим на иммунную систему. Частичная потеря сна характерна для людей, которые испытывают экологический или психологический стресс, например, из-за переездов через часовые пояса, посменной работы, а также для людей с психическими или физическими расстройствами. Ограничение сна становится все более распространенным явлением, особенно среди занятого населения среднего возраста [1], [2]. В современном обществе, работающем по принципу "24 часа в сутки", повышенные требования к работе являются основной причиной хронического недосыпания, что приводит к увеличению количества несчастных случаев, заболеваний и даже смертности [3]. Важно понимать механизмы, с помощью которых связаны сон, иммунные реакции и здоровье, если мы хотим найти способы лечения пациентов с нарушениями сна и людей с хроническим ограничением сна.
Достаточный сон жизненно важен для здоровья сердечно–сосудистой системы, а сокращение продолжительности сна, в частности, связано с повышением сердечно-сосудистой заболеваемости [4]-[6]. Доказано, что многие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая частоту сердечных сокращений, артериальное давление и концентрацию СРБ в сыворотке крови, повышаются как при кратковременном, так и при длительном ограничении сна [6]. Однако основные иммунологические механизмы, приводящие к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, еще предстоит выяснить.
В настоящем исследовании мы смоделировали накопление недосыпания в течение пяти рабочих дней, за которыми последовали два дня восстановительного сна в выходные, и измерили изменения иммунологических параметров в эти моменты времени. Мы предполагаем, что, в дополнение к ранее описанным неблагоприятным последствиям для когнитивных функций и обмена веществ [7], [8], постоянное ограничение сна нарушает иммунитет человека, что может привести к повышенному риску развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Материалы и методы
Участники и дизайн исследования
В исследовании приняли участие девятнадцать здоровых мужчин в возрасте 19-29 лет (средний возраст 23,1 [2,5] года) с регулярным графиком сна и бодрствования и обычной продолжительностью сна 7-9 часов. Физический осмотр включал анализы крови (триглицериды, холестерин, креатинин, гемоглобин, гематокрит, MCV, MCH, MCHC, лейкоциты, эритроциты, ТТГ, АСАТ, АЛАТ) и полисомнографию (таблица S1). За две недели до эксперимента участники заполнили дневники сна, провели адаптационную ночь в лаборатории сна и надели актиграфы, чтобы проверить соблюдение обычного графика сна и бодрствования. Средняя продолжительность сна до исследования составила 6,88 (0,58) ч в контрольной группе и 7,05 (0,80) ч в экспериментальной группе. Дизайн исследования был одобрен комитетом по этике Центральной больницы Хельсинкского университета, от участников было получено письменное информированное согласие, а сам эксперимент проводился в исследовательском центре мозга и работы Финского института гигиены труда.
Экспериментальная группа (n = 13) провела в постели по 8 часов в течение первых двух ночей (BL; с 11 вечера до 7 утра), затем последовали 5 ночей, в течение которых они отдыхали в постели всего 4 часа (SR; с 3 до 7 утра), и, наконец, снова 3 ночи в 8 часов в постели (ОТДЫХ). Контрольная группа (n = 6) провела в постели 8 часов (с 11 вечера до 7 утра) на протяжении всего эксперимента. Дневной сон был запрещен, и это контролировалось с помощью непрерывных записей ЭЭГ и постоянного присутствия исследователя. Питание было стандартизировано, подавалось в определенное время и завершалось всеми участниками на протяжении всего эксперимента: завтрак в 8 утра (600 ккал), обед в 12:30 (800 ккал), ужин в 18:00 (700 ккал); перекусы в 15:30 (300 ккал) и в 19:30 (200 ккал). Кроме того, участники экспериментальной группы съели по кусочку фрукта в 12:15 утра. Участникам не разрешалось покидать здание, но они могли оставаться в гостиной, где были телевизор и персональный компьютер. Освещенность в спальне и в испытательной комнате колебалась от 150 до 400 люкс, а в гостиной - от 350 до 600 люкс. Температура колебалась от 19 до 23°C.
Высокочувствительный анализ на С-реактивный белок (hs-CRP) и кортизол
Образцы крови были взяты у участников в 7.30 утра и проанализированы в лаборатории Medix Laboratories, Эспоо, Финляндия, на наличие высокочувствительного С-реактивного белка (hs-CRP) с помощью иммунотурбидиметрии. Утренние пиковые значения кортизола оценивали с помощью образцов слюны, которые брали 10 раз в день, а уровень кортизола в них измеряли с помощью коммерческого набора для анализа (Salivary Cortisol, LIA, IBL, Гамбург, Германия). Диапазон измерений составлял 0,43–110 нмоль/л, при этом повторяемость анализа составляла 5% (в пределах серии) и 8% (между сериями).
Измерение частоты сердечных сокращений и артериального давления
С помощью ЭКГ (WinAcq, AbsoluteAliens, Финляндия) измеряли частоту сердечных сокращений и постоянное систолическое и диастолическое артериальное давление (Portapres, Finapres Medical Systems, Нидерланды) между 8 и 9 часами утра во время 10-минутного периода отдыха.
Мононуклеарные клетки периферической крови и проточная цитометрия
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из гепаринизированной венозной крови методом центрифугирования в градиенте плотности, как описано ранее [9]. Затем распределение РВМС в клетках оценивали методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) с использованием программного обеспечения FACSComp версии 4.01 (BD Biosciences) [9]. Вкратце, PBMC инкубировали с (фикоэритрин-Cy5 (PE-Cy5)-конъюгированным анти-CD3 или с PE-конъюгированным анти-CD4, анти-CD56, анти-CD19) или с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC)-конъюгированным анти-CD8 или анти-CD14, и соответствующими контрольными изотипами, все они были получены от BD Biosciences. После инкубации с моноклональными антителами клетки промывали и фиксировали в 1% растворе параформальдегида (BD Biosciences). Было собрано в общей сложности 10000 событий в клетках лимфоцитов и моноцитов. Количество CD14+ клеток (моноцитов) в составе моноцитарных клеток и CD3+ (Т-клеток), CD3+CD4+ (Т-хелперных клеток), CD3+CD8+ (цитотоксических Т-клеток), CD3-CD56+ (естественных киллеров, NK-клеток) и CD19+ клеток (В-клеток) в популяции лимфоцитов были проанализированы с помощью программного обеспечения BD CELLQuestPro (BD Biosciences).
Анализ распространения PBMC
Выделенные PBMC дважды промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), и пролиферацию PBMC проводили в полной RPMI 1640, содержащей 5% термоинактивированной сыворотки AB человека, на 96-луночных планшетах с U-образным дном (Costar Corning Incorporated, Корнинг, Нью-Йорк, США), как описано ранее [9]. Вкратце, РВМС культивировали в трех экземплярах (105 клеток/200 мкл/лунка) отдельно или вместе с фитогемагглютинином (PHA, 45 мкг/мл; Murex Biotech Ltd, Дартфорд, Великобритания). После 3 дней культивирования в течение 24 часов добавляли тритиированный метил-тимидин ([метил-3H]-TdR, Amersham Biosciences, Литтл-Чалфонт, Великобритания). Результаты были рассчитаны как индексы стимуляции (поглощение изотипа в стимулированной культуре/поглощение изотипа в контрольной культуре без стимуляции среды) и выражены в процентах от индивидуальных исходных уровней.
Анализ цитокинов
Отделенные и промытые РВМС стимулировали PHA (45 мкг/мл) в полной среде RPMI 1640 на 24-луночных планшетах (Costar) (3×106 клеток/1,5 мл/лунка). Общее количество клеток при стимуляции составило 6×106. Клеточные гранулы собирали после 6 ч инкубации и использовали для выделения РНК. Супернатанты клеточных культур получали после 24-часовой инкубации и хранили при температуре -70°C до измерения уровня цитокинового белка.
Полное выделение РНК, синтез кДНК и количественную ПЦР в реальном времени с помощью системы быстрой ПЦР в реальном времени ABIPrism 7500 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) проводили, как описано ранее [9]. Праймеры и зонды для ПЦР были разработаны и приобретены в компании Applied Biosystems. Результаты были рассчитаны методом сравнительной компьютерной томографии в соответствии с инструкциями компании Applied Biosystems с использованием рибосомальной 18-й пробы в качестве эндогенного контроля.
Анализ белков цитокинов проводили с помощью системы Luminex bead (система Bio-Plex 200, Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) с использованием пар антител, улавливающих цитокины (Bio-Rad Laboratories).
Статистический анализ
Данные были представлены в процентах от исходных значений каждого отдельного участника, если не указано иное. Мы сравнили показатели ограничения сна и восстановления сил с исходными значениями, применив парные t-тесты для различий с нормальным распределением и ранговые тесты Уилкоксона для различий, которые не были нормально распределены. Достоверность различий проверяли с помощью критерия соответствия Колмогорова-Смирнова. Статистически значимым считалось значение P<.05. Все статистические анализы проводились с использованием SPSS версии 15 (SPSS Inc., Чикаго, США).
Результаты
Распределение PBMC по ячейкам
Распределение клеток в периферической крови характеризует общий иммунный статус этих людей. Общее количество Т-клеток (рис. 1), а также количество Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток не менялось на протяжении всего эксперимента ни в экспериментальной, ни в контрольной группе (таблица S2). Количество NK-клеток значительно снизилось после периода ограничения сна (до 65% от исходного уровня, р<0,005), вернувшись к исходному уровню после восстановления (89% от исходного уровня; рис. 1). Количество В-клеток значительно увеличилось после периода ограничения сна (до 121% от исходного уровня, р<0,005) и снова вернулось к исходному уровню после восстановления (111% от исходного уровня; рис. 1). В контрольной группе количество В-клеток и NK-клеток не менялось на протяжении всего эксперимента (рис. 1).
Уровень СРБ, частота сердечных сокращений, кровяное давление и кортизол
С-реактивный белок (СРБ) является важным фактором риска развития многих заболеваний, включая инсульт и гипертонию [10], [11]. Уровень СРБ в сыворотке крови значительно повышался после ограничения сна (на 145% [р<0,05] от исходного уровня), причем повышение было еще более выраженным после восстановительного сна (на 231% [р<0,05] от исходного уровня; рис. 2). Частота сердечных сокращений увеличивалась на протяжении всего эксперимента, достигнув значимого значения после восстановления (108% [p<0,05] от исходного уровня; таблица S2). С другой стороны, концентрация гормона стресса кортизола не изменилась после ограничения сна (таблица 2). Показатели артериального давления оставались неизменными на протяжении всего исследования (таблица S2). В контрольной группе уровень СРБ, частота сердечных сокращений, кортизол и артериальное давление не изменялись во время эксперимента (таблица S2).
Увеличение количества активированных PBMC
Пролиферация PHA-активированных PBMC отражает иммунологическую способность клеток периферической крови. Пролиферация PBMC в экспериментальной группе была значительно увеличена после ограничения сна по сравнению с исходным уровнем (до 233% [p<0,05] от исходного уровня; рисунок 2). После восстановительного сна все еще наблюдалась тенденция к увеличению пролиферации (341% [р = 0,53] от исходного уровня). Напротив, пролиферация клеток в контрольной группе снизилась до 81% (р<0,05) и 90% (р = 0,35) от исходного уровня, соответственно (рис. 2).
Выработка цитокинов PHA-активированным PBMC
Цитокиновые профили активированного РВМС отражают доминирующие иммунные реакции. Количество провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 значительно возросло на уровне мРНК (до 137% [р<0,05] и 163% [р<0,05] от исходного уровня соответственно), тогда как уровень белка TNF-α снизился после ограничения сна (до 80% [р<0,05]).0,05] от базовых уровней; рисунок 3). После восстановительного сна концентрации IL-6, IL-1β и TNF-α не полностью возвращались к исходному уровню. Экспрессия IL-17 на уровне мРНК значительно возросла после ограничения сна (на 138% [р<0,05] от исходного уровня) и на уровне белка после последующего восстановительного сна (на 119% [р<0,05] от исходного уровня). Экспрессия мРНК всех цитокинов в контрольной группе оставалась на исходном уровне во все моменты времени.
Обсуждение
Хроническое недосыпание становится все более распространенным явлением в современном 24-часовом обществе из-за добровольного ограничения сна и растущих требований к работе [1], [2]. Потеря сна приводит к усталости и нарушению когнитивных функций [8], но это также влияет на иммунные функции, приводя к увеличению числа инфекций [12], [13]. Более того, как эпидемиологически, так и экспериментально было показано, что сокращение продолжительности сна связано с повышенным риском развития диабета [14], ожирения [15] и сердечно–сосудистых заболеваний [4]-[6]. Учащенное сердцебиение является признаком стресса в сердечно-сосудистой системе [16]. В настоящем исследовании частота сердечных сокращений была значительно увеличена в конце эксперимента. Это можно рассматривать как тревожную реакцию системы кровообращения, которая, по крайней мере частично, может быть следствием снижения парасимпатического тонуса и/или повышения симпатического тонуса вегетативной нервной системы (ВНС). Уровень кортизола в сыворотке крови и кровяное давление оставались неизменными на протяжении всего текущего эксперимента, вероятно, из-за того, что для развития хронических изменений этих параметров требуется больше времени. Действительно, было показано, что более длительный период шестичасового сна, ограниченный 4 часами в сутки, приводит к повышению вечерней концентрации кортизола [17].
NK-клетки - это фагоциты врожденного иммунитета, которые быстро распознают, поглощают и уничтожают внутриклеточные патогены, в то время как Т-клетки и В-клетки управляют адаптивным иммунитетом посредством клеточных и гуморальных реакций. Мы наблюдали уменьшение количества NK-клеток, а также увеличение количества В-клеток после пяти ночей ограничения сна. С другой стороны, не было обнаружено изменений в количестве Т-клеток или их подтипов CD4+ и CD8+. Было показано, что лишение сна, а также стрессовые факторы снижают количество и функцию NK-клеток, что часто ассоциируется с повышенной восприимчивостью к инфекциям [18], [19]. Однако следует отметить, что количество как NK-клеток, так и В-клеток вернулось к исходному уровню в течение двух ночей восстановительного сна в настоящем исследовании. Это говорит о том, что различия в количестве этих клеток в кровотоке, вероятно, обусловлены обратимым перераспределением этих клеток между лимфоидными органами и периферией. Помимо количества клеток, ключевую роль в успешном иммунитете играет функция иммунных клеток.
В нашем исследовании периферические Т-клетки продемонстрировали значительно повышенную реакцию пролиферации на PHA. Это говорит о том, что Т-клетки у людей, лишенных сна, по сравнению с людьми с нормальным сном, активированы и после неспецифической стимуляции реагируют более эффективно. Аналогичный эффект наблюдался в недавнем исследовании, в котором мыши, подвергшиеся стрессу, выжили так же хорошо или даже лучше, чем мыши без стресса, во время первичной пневмококковой инфекции, но их выживаемость была сильно снижена во время вторичной инфекции [20]. Предполагалось, что это связано с временным усилением иммунитета, которое позже трансформировалось в снижение адаптивного иммунного ответа. В более тяжелых случаях хроническая потеря сна у крыс приводила к серьезному воспалению тканей организма, кульминацией которого была летальная бактериальная инвазия в кровоток [21]. Таким образом, чрезмерная активация эффекторных клеток может повысить иммунитет и помочь человеку выжить в чрезвычайных условиях в краткосрочной перспективе, но затягивание этой ситуации приводит к воспалению и повреждению тканей.
СРБ широко используется в качестве общего маркера воспаления [10]. В настоящем исследовании концентрация hs-CRP в сыворотке крови была повышена сразу после ограничения сна, и, поскольку период полураспада этого пептида in vivo составляет 19 часов [22], это повышение сохранялось после двух дней восстановительного сна. Аналогичным образом, предыдущее исследование показало, что как полное (88 часов), так и частичное (4,2 часа в течение 10 ночей подряд) ограничение сна значительно повышало концентрацию hs-CRP в сыворотке крови [6]. Повышенный уровень СРБ в сыворотке крови является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и предсказывает будущие сердечно-сосудистые события и даже смертность у внешне здоровых людей [10], [23]. СРБ совместно с модифицированными липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) локализуется в атеросклеротических бляшках человека, и было показано, что он повышает адгезию тромбоцитов к эндотелиальным клеткам. Таким образом, СРБ не только выступает в качестве биомаркера, но и играет причинно-следственную роль в развитии атеросклероза и тромбоза [11]. Исследования на животных также подтверждают провоспалительную и проатерогенную роль СРБ, поскольку введение человеческого СРБ или избыточная экспрессия СРБ у мышей с дефицитом аполипопротеина Е способствует развитию спонтанного атеросклероза [24]. Ранее сообщалось, что синтез СРБ в печени контролируется провоспалительными цитокинами, включая IL-6, TNF-α и IL-1 [25]. В нашем исследовании выработка IL-6 и IL-1β была явно повышена за счет активации PHA PBMC после ограничения сна и оставалась повышенной после восстановительного сна, тогда как выработка TNF-α была немного снижена, но восстановилась после двух дней восстановительного сна. Цитокины IL-1 и IL-6 играют решающую роль в иммунной защите, и их секреция также регулирует ритмы сна-бодрствования и характер засыпания соответственно [26]. В соответствии с результатами нашего исследования, недавно было показано, что уровень IL-6 повышался при длительном ограничении сна, когда испытуемые спали всего по 4 часа в сутки в течение 12 дней [27]. Независимо от высокого уровня холестерина или маркеров повреждения миокарда, IL-6 предсказывает будущие неблагоприятные сердечно-сосудистые события и отражает повышенную воспалительную активность в бляшках и, следовательно, является сильным маркером повышенного риска смертности при заболеваниях коронарных артерий [28], [29]. IL-1β является провоспалительным цитокином; превращение его неактивной формы (про-IL-1β) в активную форму запускается микробиологическими продуктами и метаболическим стрессом, что приводит к повышенной активации лимфоцитов и разрушению местных тканей. Таким образом, секреция биологически активного белка IL-1β может индуцироваться, когда люди, лишенные сна, инфицированы (т.е. имеют повышенную восприимчивость к вирусным и бактериальным инфекциям), что часто ассоциируется с хроническим недосыпанием.
В настоящем исследовании пятидневное ограничение сна было связано с увеличением выработки IL-17 как на уровне мРНК, так и на уровне белка из PHA-активированного PBMC, и количество IL-17 оставалось повышенным после периода восстановления. IL-17 - относительно недавно открытый представитель группы провоспалительных цитокинов. Он играет ключевую роль в поддержании поврежденных тканей в нескольких областях, таких как мозг, суставы, сердце, легкие и кишечник, иногда способствуя развитию аутоиммунных заболеваний [30]. Воспаление является важным компонентом на всех стадиях атеросклероза, и, что интересно, недавно было обнаружено, что IL-17 стимулирует экспрессию CRP в гепатоцитах и гладкомышечных клетках коронарных артерий [31]. На основании этих результатов мы выдвигаем гипотезу о развитии сердечно-сосудистых заболеваний, вызванных ограничением сна (рис. 4). Длительное ограничение сна приводит к активации синтеза провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-6, которые, в свою очередь, повышают экспрессию IL-17. Эти цитокины играют важную роль в выработке СРБ, который может способствовать, прямо или косвенно, образованию атеросклеротических бляшек, что приводит к повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний. Этот пагубный путь может быть еще более активирован при одновременном воздействии микробной инфекции. Однако понимание механизмов взаимодействия IL-17 с врожденным и адаптивным иммунитетом все еще находится в зачаточном состоянии, и поэтому специфическая роль IL-17 в развитии сердечно-сосудистых заболеваний нуждается в более детальном изучении.
В заключение мы выяснили, как длительное ограничение сна может изменить функции иммунных клеток и привести к повышенному риску развития сердечно-сосудистых заболеваний. Некоторые иммунологические изменения, произошедшие после пяти дней ограничения сна, восстановились после двух ночей нормального сна, но повышенный уровень сывороточного hs-CRP, сопровождавшийся повышенной выработкой провоспалительных цитокинов, особенно IL-17, не нормализовался. Таким образом, эти результаты показывают, что иммунологические изменения, которые происходят после нескольких ночей короткого сна, не могут быть полностью восстановлены при нормальном сне в течение нескольких ночей, а длительное ограничение сна может привести к повышенному риску развития сердечно-сосудистых заболеваний.
