Вступление
Нейрогенез гиппокампа взрослого человека (АН) - это непрерывный процесс, посредством которого клетки пролиферируют в субгранулярной зоне зубчатой извилины, созревают в гранулярные клетки и, в конечном счете, встраиваются в нейронные сети гиппокампа (обзор см. в Aimone et al., 2014). У грызунов нейроны гиппокампа взрослого организма, по-видимому, имеют решающее значение для различных форм адаптивного поведения, таких как обучение (Shors et al., 2001), разделение паттернов (Clelland et al., 2009) и реакции на стресс (Snyder et al., 2011). Аэробные упражнения, например бег увеличивает AHN и улучшает когнитивные функции как у самцов, так и у самок взрослых грызунов (van Praag et al., 1999, 2005; Creer et al., 2010; Marlatt et al., 2012; Фарделл и др., 2012). Сообщается, что увеличение AHN в ответ на бег отчасти связано с увеличением числа выживших клеток-предшественников нейронов (тип 2), а не с сокращением клеточного цикла (Fischer et al., 2014). Существуют также исследования, указывающие на то, что бег увеличивает выживаемость и включение недавно разделившихся клеток гиппокампа, которые образуются за несколько дней до начала тренировки, для усиления общего нейрогенеза (Lee et al., 2013; Castilla-Ortega et al., 2014). Считается, что увеличение AHN обусловлено усилением регуляции факторов, включая нейротрофический фактор головного мозга (BDNF; Farmer et al., 2004; Li et al., 2008; Marlatt et al., 2012) и инсулиноподобный фактор роста 1 (Carro et al., 2000; Trejo et al., 2001).). Помимо гиппокампа, физические упражнения также усиливают нейрогенез у взрослых в субвентрикулярной зоне (Bednarczyk et al., 2009; Chae et al., 2014) и в гипоталамусе (Niwa et al., 2015), что позволяет предположить, что нейрогенный эффект физических упражнений может проявляться во всем мозге.Изучение влияния физических упражнений на АН на животных моделях по большей части ограничивалось изучением влияния бега. У людей различные формы анаэробных упражнений, такие как силовые тренировки, моделировались на крысах с использованием прогрессивного режима тренировок на вертикальной лестнице с отягощениями, прикрепленными к основанию хвоста (Hornberger & Farrar, 2004), а также комбинаций аэробных и анаэробно-анаэробных упражнений, таких как высокоинтенсивные интервальные тренировки. тренинги (HIT; обзор см. в Gibala et al., 2012) набирают все большую популярность. Высокоинтенсивная интервальная тренировка у грызунов представляет собой режим чередующихся коротких периодов очень интенсивных анаэробных упражнений, таких как бег на беговой дорожке со скоростью 85-90% от максимальной, с короткими периодами восстановления и повторением этого цикла для завершения тренировки продолжительностью до часа (см., например, Харам и др., 2009). Высокоинтенсивные интервальные тренировки могут увеличить максимальное потребление кислорода (urn: x-wiley: 00223751:media: tjp7095:tjp7095-math-0002), обычно используемый показатель аэробной подготовленности, у грызунов в той же степени или даже в большей, чем умеренные длительные аэробные упражнения (Haram et al., 2009). Недавнее исследование, проведенное на здоровых взрослых крысах-самцах, показало большее увеличение индукторов нейропротекторных факторов (H2O2 и фактора некроза опухоли α), а также BDNF и нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеток, в образцах головного мозга в ответ на HIT по сравнению с непрерывными тренировками (Afzalpour et al., 2015).. Насколько нам известно, прямое воздействие HIT на АН не изучалось, и существует мало сообщений о влиянии чисто анаэробных упражнений на АН. У взрослых крыс-самцов постепенная тренировка с отягощениями на вертикальной лестнице увеличивала выработку инсулиноподобного фактора роста 1, но не BDNF в гиппокампе (Cassilhas et al., 2012a). Сообщается также, что силовые тренировки способствуют пролиферации клеток гиппокампа (Novaes Gomes et al., 2014) и улучшают пространственное обучение (Cassilhas et al., 2012a, b). Следует отметить, что принудительные физические упражнения обычно включают в себя поощрение или наказание животных, чтобы мотивировать их к выполнению упражнений. Например, для поощрения крыс продолжать бег на беговой дорожке обычно используются легкие удары электрическим током. Эти удары, вероятно, вызывают у животных негативный стресс. Хорошо известно, что особенно длительный и непредсказуемый стресс подавляет нейрогенез у взрослых (недавний обзор см. в Lucassen et al., 2015), в то время как умеренный стресс может усиливать АН (Parihar et al., 2011).
В дополнение к типу физических упражнений, влияние физических упражнений на АН, вероятно, частично зависит от индивидуальных особенностей реакции на физические нагрузки. Хотя аэробные упражнения в среднем полезны для здоровья, их воздействие у разных людей различается, предположительно, в результате значительных генетических различий. Для некоторых аэробные тренировки обеспечивают существенный прирост максимальной аэробной работоспособности (urn: x-wiley: 00223751:media: tjp7095:tjp7095-math-0003) и метаболического здоровья, в то время как для других такое же количество тренировок приводит к незначительным или даже отрицательным изменениям (Bouchard & Rankinen, 2001; см. также Timmons, 2011; Бушар и др., 2012). В нескольких исследованиях, проведенных под клиническим наблюдением, сообщается, что до 20% участников не смогли увеличить количество упражнений urn:x-wiley: 00223751:media: tjp7095:tjp7095-math-0004, и их можно считать невосприимчивыми. Исследования, изучающие предикторы отсутствия реакции, показывают, что группы, которые тренируются в больших объемах (более длительные тренировки при той же относительной интенсивности), имеют более высокую вероятность ответа (Sisson et al., 2009).
Недавно мы разработали контрастную систему на крысиной модели для определения низкой (LRT) и высокой (HRT) реакции на аэробные упражнения (Koch et al., 2013). Начав с основной популяции генетически гетерогенных крыс (N/NIH), мы применили двусторонний искусственный отбор, основанный на величине изменения способности к бегу после завершения 8 недель стандартизированных аэробных тренировок на беговой дорожке. После 15 поколений отбора крысы, выведенные в режиме HRT, увеличили максимальную дистанцию бега по беговой дорожке с 646 до 869 м (изменение на 223 ± 20 м), тогда как крысы, выведенные в режиме LRT, сократили с 620 до 555 м (изменение на -65 ± 15 м) после завершения того же абсолютного объема тренировок (Koch et al 2013). Обратите внимание, что для разведения используются только те крысы, которые полностью выполняют режим физических упражнений, чтобы гарантировать отсутствие существенных различий в мотивации к физическим упражнениям между двумя линиями крыс. В результате отбора подавляющее большинство крыс, получавших ЗГТ, демонстрируют явное увеличение ряда показателей кардиореспираторной подготовленности, таких как способность к бегу, urn: x-wiley: 00223751:media: tjp7095:tjp7095-math-0005 и функция клеток сердечной мышцы (Wisløff et al., 2015). Напротив, эти же показатели кардиореспираторной подготовленности не изменяются и даже снижаются у крыс, получавших LRT, несмотря на успешное выполнение режима тренировок. Важно отметить, что исходных различий в кардиореспираторной подготовленности между крысами, получавшими LRT и HRT, не существует, т.е. в нетренированных условиях крысы, получающие как LRT, так и HRT, обладают сопоставимыми физическими возможностями (Wisløff et al., 2015). По сравнению с крысами, получавшими HRT, крысы, получавшие LRT, демонстрировали нарушение ангиогенеза скелетных мышц, измененную передачу сигналов для JNK и протеинкиназы, активируемой митогеном p38 (Lessard et al., 2013), и имели более низкие уровни факторов, регулирующих биогенез митохондрий (рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором, гамма-коактиватор 1 альфа, ядерный респираторный фактор 1 и митохондриальный фактор транскрипции А; Marton et al., 2015), что свидетельствует о снижении пластичности мышц, вызванной физической нагрузкой. Микрочип РНК из скелетных мышц указывает на большие различия между крысами, получавшими LRT и HRT, в транскрипционных реакциях на одни и те же физические нагрузки (Lessard et al., 2013). Действительно, причиной создания крыс с HRT и LRT было создание контрастных полигенных моделей для более детального изучения так называемой гипотезы переноса энергии (Koch & Britton, 2008). Согласно этой гипотезе, способность к передаче энергии, которая обычно измеряется с помощью максимальной аэробной нагрузки, может быть центральным механическим фактором, определяющим разницу между сложными метаболическими заболеваниями и здоровьем.
Здесь, используя эту уникальную контрастирующую систему на крысиных моделях HRT и LRT, мы попытались проверить, сопоставимы ли HIT (эксперимент 1) и силовые тренировки (эксперименты 2 и 3) с аэробными упражнениями (бег на колесах и тренировка на выносливость на беговой дорожке) с точки зрения повышения AHN у самцов крыс. Основываясь на литературе, рассмотренной выше, мы ожидали, что HIT будет способствовать развитию АН. Что касается силовых тренировок, мы ожидали увидеть увеличение количества пролиферирующих клеток в гиппокампе (Novaes Gomes et al., 2014). Мы предположили, что генетическая предрасположенность не будет влиять на исходный уровень АН, но что по сравнению с контрольными животными, ведущими малоподвижный образ жизни, физические нагрузки, в целом, будут в большей степени способствовать развитию АН у крыс, получающих ЗГТ, по сравнению с крысами, получающими ЛЗТ.
Методы
Этическое одобрениеВсе экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с директивой Европейского парламента 2010/63/EU и одобрены Национальным советом по экспериментам на животных Финляндии.
Животные и группы
Все животные содержались в помещении отдела исследований животных Университета Ювяскюля. Корм и вода были в свободном доступе, а температура и влажность в помещении поддерживались на уровне 21 ± 2°C и 50 ± 10% соответственно. Всем крысам в качестве подстилки на дно клетки были положены осиновые щепки (Tapvei, Kaavi, Финляндия). Крысам, помещенным в клетки без колесиков, были предоставлены деревянные игрушки. Крыс содержали в течение 12–часового цикла "свет–темнота", включив свет в 08:00. Все процедуры проводились в светлое время суток.
Эксперимент 1
Схема эксперимента изображена на рис. 1А. Животными были 88 взрослых самцов крыс линии LRT и HRT, представляющих 17-е поколение этих линий крыс, выведенных путем селекции и поддерживаемых в Мичиганском университете (Анн-Арбор, Мичиган, США; Koch et al., 2013). Всех крыс содержали поодиночке, и в начале эксперимента им было около 8 месяцев. Средняя масса тела составила 388 ± 6 г у крыс, получавших HRT, и 403 ± 6 г у крыс, получавших LRT. Животные не были фенотипизированы по их реакции на тренировку, чтобы сохранить их наивными в отношении физических упражнений. Животные как из линий LRT, так и из линии HRT были разделены на следующие четыре группы лечения. (i) Сидячие крысы (Sed) не подвергались никаким физическим нагрузкам и все время проводили в своей домашней клетке (Tecniplast 1354, Италия; размер: 595 мм × 380 мм × 200 мм). (ii) Контрольных (C) крыс тестировали на аэробную выносливость в начале и в конце 7-недельного эксперимента. Половина животных в группе С содержалась в стандартных клетках, а половина - в клетках (Tecniplast 2154; 480 мм × 265 мм × 210 мм), оснащенных отключенным ходовым колесом. (iii) Крыс, занимающихся бегом (RW), содержали в клетках, оборудованных активными беговыми колесами, в течение всего периода проведения физических упражнений (7 недель). Животных в группе RW также тестировали на аэробную выносливость до и после тренировки на беговых колесах. (iv) Высокоинтенсивные интервальные тренировки (HIT) крыс содержали в обычных клетках и тренировали на беговой дорожке три раза в неделю. Крысы из группы HIT проходили тестирование на аэробную выносливость один раз в неделю, чтобы поддерживать оптимальные параметры тренировок (пожалуйста, смотрите подробности в разделе "Тесты на физическую работоспособность и режимы тренировок" ниже). В результате были сформированы следующие восемь групп: LRT-Sed (n = 8), LRT-C (n = 12), LRT-RW (n = 12), LRT-HIT (n = 12), HRT-Sed (n = 8), HRT-C (n = 12), HRT-RW (n = 12) и HRT-HIT (n = 12).
Эксперимент 2
Схема эксперимента представлена на рис. 2А. Животными были 28 взрослых самцов крыс линии LRT и HRT, представляющих 18-е поколение этих линий крыс. По прибытии в Университет Ювяскюля крысам дали акклиматизироваться в течение 4-5 недель. После этого, когда крысам исполнилось около 6 месяцев, их протестировали на их реакцию на аэробные нагрузки. Всех крыс подвергали 8-недельному режиму физических упражнений, в течение которого они тренировались на беговой дорожке три раза в неделю (подробности смотрите в разделе "Тесты на физическую работоспособность и режимы тренировок"). Затем крыс разделили на четыре тренировочные группы, подобранные по массе тела и способности к аэробной тренировке, и либо продолжили тренировку в виде аэробной выносливости на беговой дорожке, либо заменили на тренировку подъема по лестнице с отягощениями следующим образом: (i) Крысы LRT, подвергнутые тренировке с отягощениями [LRT-Res, n = 6; 417 ± 17 г, адаптивный ответ на 8 недель аэробных тренировок (подробнее см. раздел “Тесты на физическую работоспособность и режимы тренировок”): 9 ± 5%]; (ii) крысы LRT, подвергнутые аэробной тренировке на выносливость (LRT-End, n = 8; 421 ± 14 г; 10 ± 6%); (iii) крысы с ЗГТ, подвергнутые силовой тренировке (HRT-Res, n = 6; 386 ± 15 г, 24 ± 16%); и (iv) крысы с ЗГТ, подвергнутые аэробной тренировке на выносливость (HRT-End, n = 8; 359 ± 9 г, 24 ± 16%).
Эксперимент 3
Схема эксперимента представлена на рис. 3А. Животными были 20 беспородных крыс–самцов породы Спраг-Доули, полученных из Харлана (Нидерланды). Крысам сначала дали акклиматизироваться в течение 2 недель, после чего приступили к экспериментам. В начале экспериментов крысам было 9 недель от роду, и они весили в среднем 276 ± 2 г. Крыс содержали парами; одно животное в каждой клетке подвергалось тренировке сопротивления (Res, n = 10), а другое вело сидячий образ жизни (Sed, n = 10).
Тесты на физическую работоспособность и режимы тренировок
Все протоколы тестирования максимальной работоспособности и тренировки на выносливость, проводимые на беговой дорожке, были адаптированы на основе протокола, разработанного для целей селекции (Koch et al., 2013). За 15 поколений (n = 3114) мы обнаружили, что более 90% фенотипированных крыс успешно справляются с этим типом тренировочной программы. Более подробная информация представлена ниже.
Эксперимент 1
Тест с физической нагрузкой на максимальную способность к бегу
Тренировочный тест на максимальную скорость бега проводился до и после тренировки. Во всех экспериментах для проверки максимальной скорости бега использовалась специально изготовленная беговая дорожка. Пространство для бега каждой крысы составляло 9 см × 70 см, а в конце дорожки была расположена электрифицированная сетка размером 9 см × 9 см. Электрифицированная сеть в конце дорожки вызывала легкий удар электрическим током (регулируется в диапазоне от 0,2 до 2 мА; обычно устанавливается на 1 мА) и использовалась для обучения крыс бегу на беговой дорожке и оценки максимальной беговой способности. Если крыса соскальзывала с беговой дорожки и оставалась на электрифицированной решетке более 5 секунд, вместо того чтобы продолжать бег, беговой тест прекращался, а крысу снимали с беговой дорожки. К сожалению, беговая дорожка не включала счетчик частоты ударов. По завершении каждого сеанса регистрировали время, проведенное на беговой дорожке. Протокол теста был следующим. Сначала крысам давали размяться в течение 5 мин со скоростью 8-9 м/мин−1. Само испытание начиналось со скорости 10 м/мин−1, после чего скорость увеличивалась на 2,4 м/мин−1 каждые две минуты. Тест проводился три раза подряд, и наилучший результат (скорость, измеряемая в метрах в минуту), полученный для каждой крысы, считался наилучшей оценкой максимальной способности к бегу, как описано ранее (Koch & Britton, 2001).
Добровольная тренировка на беговом колесе
Крысы имели свободный доступ к RW в домашней клетке в течение 7 недель. Дистанция, пройденная ими, непрерывно регистрировалась компьютеризированной системой с использованием специально разработанного программного обеспечения. Сбор данных начинался, когда RW начинал двигаться, и данные сохранялись в течение 2 минут. В сочетании с добровольным бегом на беговом круге не применялось никаких мотивирующих наказаний или поощрений.
Высокоинтенсивная интервальная тренировка
Крыс подвергали нагрузке HIT три раза в неделю, с перерывом в 1-2 дня восстановления между каждым сеансом, в течение 7 недель. Каждый сеанс HIT начинался с 5-минутной тренировки на беговой дорожке со скоростью, соответствующей 50-60% от индивидуальной максимальной скорости крысы в тесте на максимальную работоспособность. После этого каждая крыса бежала в течение 3 мин со скоростью, соответствующей 85-90% от ее максимальной, а затем снова в течение 2 мин со скоростью, равной 50% от ее максимальной. Это 5-минутное испытание проводилось в общей сложности три раза за сеанс, что означает, что общая продолжительность сеанса составила 20 минут. В течение всего периода тренировок наклон беговой дорожки составлял 10° в гору. Чтобы поддерживать параметры режима тренировок HIT в актуальном состоянии, раз в неделю проводился тест на максимальную работоспособность (один тестовый сеанс, заменяющий тренировку HIT). Во время HIT использовалась электрифицированная решетка в конце дорожки для бега, чтобы побудить крыс продолжать бег (см. также "Тренировочный тест на максимальную способность к бегу" выше); однако, чтобы свести к минимуму воздействие ударов током, крыс мягко подталкивали рукой, чтобы они не сходили с ленты беговой дорожки и не попадали на нее. сетка. Если крыса неоднократно соскальзывала с ленты беговой дорожки и оставалась на электрифицированной решетке более 5 секунд вместо того, чтобы продолжать бег, тренировка прекращалась, а крысу удаляли с беговой дорожки.
Сидячий
Крысы в сидячих группах (C и Sed) не занимались физическими упражнениями. Крысы из группы С были протестированы на максимальную способность к бегу (см. "Тест с физической нагрузкой на максимальную способность к бегу" выше) до и после 7-недельного вмешательства. Крысы из группы Sed не были протестированы на максимальную способность к бегу и не подвергались каким-либо физическим тренировкам во время исследования.
Эксперимент 2
Тест на адаптивную реакцию к аэробным тренировкам
Протокол включал следующие четыре этапа: (i) ознакомление; (ii) базовый тест на максимальную беговую способность перед тренировкой; (iii) 8 недель аэробных тренировок на моторизованной беговой дорожке; и (iv) тест на максимальную беговую способность после тренировки, как описано ранее (Koch et al., 2013). Короче говоря, все крысы были приучены к бегу на беговой дорожке в течение как минимум 3 дней по 10-20 минут за раз. Скорость бега на беговой дорожке слегка увеличивали на каждом сеансе, так что в конце ознакомления каждая крыса могла бегать со скоростью 10 м/мин−1. После этого крысы отдыхали не менее 1 дня, прежде чем выполнить тест на максимальную работоспособность перед тренировкой. Для получения достоверной оценки исходного уровня производительности были проведены трехкратные тесты на бег по беговой дорожке с ускорением. Каждое испытание проводилось под углом 15°, начиная со скорости 10 м/мин−1 без разминки. Скорость бега увеличивали на 1 м/мин−1 каждые две минуты, пока крыса не выбивалась из сил. Обратите внимание, что этот результат теста отражает исходную максимальную беговую способность крыс, и никакой разницы не ожидалось (или не наблюдалось; пожалуйста, ознакомьтесь с результатами) между линиями HRT и LRT rat.
Через два-четыре дня после последнего базового теста были начаты аэробные тренировки. В первый день крысы бегали со скоростью 10 м/мин−1 в течение 20 минут. Скорость постепенно увеличивали (на 1 м мин−1) через каждые два сеанса до максимальной скорости 20 м мин−1, если крыса была в состоянии поддерживать эту скорость во время тренировки. Кроме того, продолжительность тренировки была увеличена на 0,5 минуты с каждым занятием до 30 минут за сеанс. Тренировки проводились три раза в неделю (понедельник, среда и пятница) в течение 8 недель. Наклон беговой дорожки поддерживался на постоянном уровне 15°. Для мотивации животных продолжать бег на беговой дорожке использовались такие методы, как удары, толчки рукой и легкие удары электрическим током. После тренировки максимальная скорость бега была снова проверена по методике, идентичной той, которая использовалась во время базовых тестов, и была зафиксирована максимальная скорость бега. Обратите внимание, что на данный момент ожидалось (и наблюдалось; пожалуйста, ознакомьтесь с результатами), что крысы, получавшие ЗГТ, увеличат свою максимальную способность к бегу в большей степени по сравнению с крысами, получавшими ЛЗТ, у которых увеличение было незначительным или вообще отсутствовало (и наблюдалось; пожалуйста, ознакомьтесь с результатами и рис. 2Б).
Тренировка на выносливость
Тренировки на моторизованной беговой дорожке проводились три раза в неделю в течение 6 недель, с перерывом как минимум на 1 день отдыха между каждой тренировкой. Угол наклона ленты оставался постоянным и составлял 15° в гору. Первая тренировка длилась 25 минут, и с каждой неделей продолжительность тренировки увеличивалась на 1 минуту. Начальная скорость тренировки составляла 60% от средней максимальной скорости бега в каждой группе крыс и увеличивалась на 1 м/мин каждую неделю. Во время каждой индивидуальной тренировки скорость бега на беговой дорожке поддерживалась постоянной. Максимальная способность к бегу проверялась раз в 2 недели и в конце тренировки.
Тренировка с отягощениями
Протокол тренировки с отягощениями был модифицирован по сравнению с тем, который использовали Хорнбергер и Фаррар (2004), и тренировка длилась 6 недель. Крыс, получавших HRT и LRT, трижды в течение первой недели знакомили с изготовленной на заказ вертикальной лестницей (высота × ширина: 90 × 15 см, расстояние между ступенями 2 см, наклон 85°). В первый день крысы лазали без дополнительной нагрузки. В последующие 2 дня к проксимальной части хвоста с помощью двустороннего скотча и ремешка на липучке прикрепляли мешочек со свинцовыми грузиками, составляющими менее 50% массы тела крысы. Затем у крыс начался период постепенных тренировок с отягощениями. Тренировки проводились три раза в неделю (понедельник, среда и пятница). Первая нагрузка составляла 75% от массы тела крысы. Когда крыса успешно преодолевала подъем с этим грузом (одно испытание), нагрузку увеличивали на 30 г и тест повторяли. Нагрузку увеличивали с шагом в 30 г до тех пор, пока крыса больше не могла доставать до верха лестницы. Наибольший груз, который крыса успешно поднимала на вершину лестницы, считался максимальной грузоподъемностью за этот сеанс. Последующие тренировки состояли из девяти попыток. Во время первых трех подъемов использовалось 50, 75 и 90% от предыдущей максимальной нагрузки. Затем нагрузка увеличивалась на 30 г до достижения новой максимальной нагрузки. Затем были предприняты три попытки с этой новой максимальной нагрузкой. Между испытаниями по лазанию крысам давали отдохнуть в течение 90 секунд в открытой камере (длина × ширина × высота: 30 см × 15 см × 11 см), расположенной на вершине лестницы. Обратите внимание, что крыс не наказывали и не вознаграждали, чтобы мотивировать их к лазанию.
Эксперимент 3
Обучение сопротивлению молодых самцов крыс Спрэга–Доули проводили, как описано в предыдущем подразделе, но продолжительность курса была увеличена до 8 недель. Сидячих питомцев поместили в специально изготовленный фанерный ящик (20 см × 30 см × 25 см) со стенами и потолком из оргстекла и разместили в тренировочном зале на время тренировки.
Иммуногистохимия
Нейрогенез взрослых изучали с использованием даблкортина (все эксперименты), бромдезоксиуридина (BrdU; эксперимент 3) и Ki67 (эксперимент 3) в качестве маркеров.
Инъекции бромдезоксиуридина
Бромдезоксиуридин (Sigma, каталожный номер B5002) вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг (15 мг/мл, разведенный в физиологическом растворе) для маркировки делящихся клеток. Инъекции бромдезоксиуридина проводились в течение первой недели обучения, за 2-6 часов до тренировки с отягощениями. Таким образом, крысам было сделано в общей сложности три инъекции, один раз через день. Доза сравнима с той, которая использовалась в нескольких предыдущих исследованиях для маркировки делящихся клеток в гиппокампе с целью изучения АН (см., например, Gould et al., 1999; Nokia et al. 2012), и никаких побочных эффектов от инъекций не наблюдалось. Доза в 200 мг/кг−1 достаточно высока, чтобы пометить большинство делящихся клеток, но в то же время достаточно мала, чтобы не быть токсичной (Cameron & McKay, 2001). Основываясь на ряде предыдущих отчетов, около 80% делящихся клеток гиппокампа, помеченных BrdU, созревают в нейроны, на что указывает двойная маркировка BrdU и нейрональных маркеров, таких как doublecortin (Dalla et al., 2009), NeuN (Leuner et al., 2010) или TuJ1 (Cameron & McKay, 2001; Лейнер и др., 2010).
Подготовка тканей
Через сорок восемь часов после последней тренировки/катания на беговых дорожках животные были умерщвлены в результате воздействия повышающейся концентрации CO2, а смерть была подтверждена пункцией сердца. Мозг немедленно извлекали и фиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS (рН 7,4) при температуре 4°C в течение 48 ч, после чего раствор параформальдегида заменяли на 0,1 м раствор PBS (рН 7,4). Затем с помощью вибратома (Leica VT 1000 S) были вырезаны коронарные срезы (толщиной 40 мкм) по всей зубчатой извилине левого или правого (рандомизированного) гиппокампа. Каждый 12-й срез собирали в пробирку, заполненную раствором криопротектора (30% сахарозы + 30% этиленгликоля в 0,1 м фосфатном буфере, рН 7,6). Затем образцы хранили при температуре -20°C до окрашивания.
Окрашивание
Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием свободно плавающих образцов. Было обеспечено, чтобы образцы из каждой группы для последующего сравнения окрашивались в одно и то же время. Сначала раствор криопротектора был промыт 0,1 м PBS (рН 7,6; три промывки по 15 минут). Затем были выполнены необходимые этапы блокирования и денатурации ДНК. Для получения даблкортина образцы сначала подвергали воздействию раствора лимонной кислоты (рН 6) при 80°C в течение 30 мин, затем выдерживали в H2O2. Для получения Ki67 образцы также кипятили в лимонной кислоте, затем смешивали как с H2O2, так и с обычной козьей сывороткой. Для окрашивания BrdU образцы сначала замачивали в 2 м растворе HCl в течение 15 минут при температуре 37°C, затем смешивали с H2O2 и обычной козьей сывороткой. После этих предварительных обработок образцы промывали (три промывки по 5 мин) в триб-буферном физиологическом растворе (TBS) с добавлением 0,3% Triton X-100 (TBS-T, рН 7,6). Первичное антитело против BrdU было получено от Becton-Dickinson (BD Pharmingen, каталожный номер 347580, произведено на мышах), как и первичное антитело к Ki67 (каталожный номер 556003, мышь). Для BrdU использовали разведение 1:100, а для Ki67 - 1:500. Окрашивание на даблкортин проводили с использованием антител к даблкортину от Santa Cruz (sc-8066, коза; разведение 1:250). Антитела разводили в TBS-T (даблкортин) или PBS-T (Ki67 и BrdU) и добавляли 2% обычной козьей сыворотки при использовании вторичных антител, полученных от коз (BrdU и Ki67). Свободно плавающие срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день образцы сначала промывали буферным раствором. Затем вводили соответствующие биотинилированные вторичные антитела (BrdU и Ki67: Abcam, ab98691, козьи анти-мышиные, разведение 1:500; и даблкортин: Vector Labs, BA-5000, rabbit anti-goat, разведение 1:500) разводили в буферном растворе и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем образцы снова промывали буферным раствором, а затем инкубировали в стрептавидине, маркированном HRP (GE Healthcare, RPN1231, разведение 1:1000) разводят в буферном растворе в течение 2 ч при комнатной температуре. Образцы снова промывали буферным раствором. Для визуализации иммуноокрашивания образцы погружали в раствор диаминобензидина (DAB; Sigma-Aldrich, D5905; 0,25 мг мл−1 в Трис-буфере, рН 7,6) с добавлением 0,075% H2O2. Реакцию останавливали максимум через 30 мин с помощью 0,1 м фосфатного буфера (рН 7,6), а затем срезы помещали на предметные стекла с использованием раствора желатина и сушили при температуре 37°C в течение ночи. Наконец, образцы, помещенные на предметные стекла, были повторно окрашены 0,1% крезиловым фиолетовым (подробнее об окрашивании крезиловым фиолетовым см. Nokia et al., 2012), обработаны ксилолом и покрыты пленкой (Depex).
Микроскопический анализ
Из окрашенных срезов были получены оценки общего количества клеток, меченных BrdU-, Ki67- или даблкортином, с использованием модифицированного протокола объективной стереологии. Экспериментаторы не знали об условиях эксперимента при подсчете клеток. По сути, количество меченых клеток в слое гранулярных клеток и в воротах подсчитывали с помощью светового микроскопа с каждого 12–го одностороннего среза по всей зубчатой извилине (по одному предметному стеклу на крысу, всего девять срезов, на 6,3-1,8 мм позади брегмы; Paxinos, 1998). Количество клеток умножили на 24, чтобы получить оценку общего количества меченых клеток в гиппокампе. Как видно из рисунка. На рис. 3С–Е показано, что новые ячейки были неплотно упакованы и их было немного, поэтому их подсчет при увеличении в 400 раз был признан оправданным. Что касается метода фракционирования, то, несмотря на то, что он может привести к пропуску некоторых групп клеток, он никоим образом не должен быть систематическим и, следовательно, не должен влиять на результаты групповых сравнений количества клеток. Кроме того, нас интересовала относительная разница между экспериментальными группами, а не столько абсолютное количество клеток.
Статистический анализ
Все статистические анализы проводились с использованием IBM SPSS Statistics версии 22. Для анализа изменений по сеансам/времени использовался ANOVA с повторными измерениями. Односторонний и одномерный ANOVA использовался для простых групповых сравнений. Скорректированные по Бонферрони значения P использовались для последующего сравнения. При анализе связей между переменными использовался коэффициент корреляции Пирсона (r). Когда размер выборки был небольшим (менее пяти), корреляции исследовались с использованием непараметрического показателя зависимости - коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs).
Результаты
Эксперимент 1. нейрогенез взрослого гиппокампа был наиболее интенсивным у крыс, получавших ЗГТ, в ответ на произвольное вращение колеса
В анализ были включены только животные с успешным срезанием и окрашиванием на даблкортин. Кроме того, одно животное из группы LRT-RW было исключено из исследования, поскольку было замечено, что оно вращало RW только передними лапами, что приводило к недостоверным данным о дистанции бега. Окончательные размеры групп указаны ниже и на каждом рисунке. Не было выявлено различий между линиями крыс, получавших HRT и LRT, по исходной максимальной скорости бега (односторонний ANOVA: F1,61 = 0,57, P = 0,454). Соответственно, крыс обеих линий отнесли к группам RW (HRT-RW, n = 9; LRT-RW, n = 11) пробежали одинаковую дистанцию в первый день (односторонний ANOVA: F1,18 = 0,763, P = 0,394). В течение первой недели тренировок (7 дней; см. рис. 1B), дистанция бега у крыс с HRT-RW увеличилась больше, чем у крыс с LRT-RW (ANOVA с повторными измерениями: основной эффект дня, F6,108 = 9,27, P < 0,001; основной эффект линии крыс, F1,18 = 17,13, P = 0,001; взаимодействие, F6,108 = 5,05, Р = 0,009). Этого следовало ожидать, учитывая, что крысы, получавшие ЗГТ, по своей природе лучше реагировали на аэробные упражнения. Средние суточные дистанции бега в течение всего периода обучения для животных в группах, получавших RW, представлены на фиг. 1С. Не было выявлено статистически значимой разницы в показателях бега на колесах между линиями крыс LRT и HRT (ANOVA с повторными измерениями: основной эффект недели, F6,108 = 13,4, P < 0,001; взаимодействие линии крыс и недели, F6,108 = 1,38, P = 0,264; основной эффект крыс, получавших LRT, был получавших HRT). линия, F1,18 = 3,96, P = 0,062). Дистанция бега у обеих линий крыс увеличивалась в течение первых нескольких недель, а затем выровнялась квадратичным образом (Р < 0,001). Средняя общая дистанция бега (в сумме за 7 недель) составила 183 ± 18 км для крыс, получавших ЗГТ, и 106 ± 32 км для крыс, получавших ЛЗТ.
В среднем крысы с ЗГТ, подвергшиеся воздействию ХИТ, завершили 89 ± 4% тренировок, а крысы с ЛЗТ - 95 ± 1% тренировок. Не было выявлено различий между линиями крыс (односторонний дисперсионный анализ: F1,18 = 2,18, P = 0,157). Соответственно, общие дистанции бега в течение 7 недель тренировок HIT у крыс с HRT и LRT были сопоставимы (F1,18 = 0,04, P = 0,844) и составили 6733 ± 454 и 6824 ± 241 м соответственно (обратите внимание на разницу в масштабе по сравнению с дистанциями бега в группах RW). Подводя итог, можно сказать, что крысы, получавшие LRT и HRT, тренировались в сопоставимой степени, когда подвергались воздействию HIT.
В соответствии с приведенными выше результатами, как бег на колесах, так и произвольный бег на колесах увеличили беговую способность у обеих линий крыс (рис. 1D), в то время как в контрольной группе произошли незначительные изменения (HRT-C, n = 11; LRT-C, n = 12; однофакторный дисперсионный анализ: основной эффект линии крыс, F1,57 = 2,19, P = 0,145; основной эффект от типа тренировки, F2,57 = 14,24, P < 0,001; взаимодействие линии крыс и типа тренировки, F2,57 = 2,56, P = 0,086). Максимальная скорость бега увеличилась в наибольшей степени в ответ на произвольное вращение колесом (post hoc-тесты с поправкой на Бонферрони: RW против HIT, P = 0,048; RW против С, Р < 0,001), но также наблюдалось значительное улучшение в группах, подвергшихся воздействию, по сравнению с контрольными группами (Р = 0,037). Максимальная скорость бега увеличилась на 3 ± 9% в группе HRT-C и на 7 ± 6% в группе LRT-C. Соответствующие процентные показатели в группах, получавших ЗГТ и ЛЗТ, составили 29 ± 11 и 26 ± 8% соответственно. В группах HRT-RW и LRT-RW соответствующие изменения максимальной скорости бега составили 67 ± 12 и 34 ± 8% соответственно. Запланированные сравнения между линиями крыс в каждой группе упражнений с использованием одностороннего ANOVA показали значительную разницу в реакции на тренировку между группами HRT-RW и LRT-RW (F1,18 = 5,74, P = 0,028), но не между группами HRT-HIT и LRT-HIT (F1,18 = 0,34, Р = 0,857). Кроме того, запланированные сравнения между двумя группами упражнений в каждой линии крыс показали более высокую реакцию на тренировку в группе HRT-RW по сравнению с группой HRT-HIT (F1,16 = 5,59, P = 0,031). Аналогичная разница не была очевидна у крыс, получавших LRT (F1,20 = 0,57, P = 0,459). В заключение, произвольный бег был более эффективен для демонстрации различной реакции на тренировку у крыс линий LRT и HRT, а также для увеличения способности к бегу у крыс линии HRT (см. рис. 1D).
Затем мы изучили возможные различия между группами в АН, измеряемом как количество даблкортин-позитивных клеток в гиппокампе. Чтобы избежать путаницы, связанной со временем окрашивания, сравнения были либо ограничены группами, окрашиваемыми в одно и то же время (HRT-C против LRT-C), либо количество нейронов было стандартизировано по сравнению с контрольной группой, ведущей сидячий образ жизни (Sed против LRT-C). ХИТ против RW). На рисунке 1Е показано, что количество даблкортин-позитивных клеток в гиппокампе крыс HRT-C и LRT-C было сопоставимым (односторонний ANOVA: F1,21 = 0,01, P = 0,933). То есть, линии, прошедшие LRT и HRT, не показали разницы в AHN в исходных (т.е. необученных) условиях. Рисунок 1F, однако, показывает, что бег и произвольный бег по-разному влияли на нейрогенез у крыс, получавших HRT и LRT (однофакторный дисперсионный анализ: основной эффект от линии крыс, F1,47 = 27,68, P < 0,001; основной эффект от типа упражнений, F2,47 = 28,34, P < 0,001; взаимодействие, F2,47 = 24,81, Р < 0,001). В частности, в гиппокампе животных, подвергнутых произвольному бегу, было больше даблкортин-позитивных клеток по сравнению с животными, подвергшимися HIT (post hoc-тест с поправкой на Бонферрони: P < 0,001), или с теми, кто вел сидячий образ жизни (Sed, P < 0,001; HIT против Sed, P = 0,057). Что еще более важно, по сравнению с HIT или сидячим образом жизни, в гиппокампе крыс с HRT, подвергнутых произвольному бегу, было больше даблкортин-позитивных клеток (односторонний ANOVA: F2,22 = 41,04, P < 0,001; Post hoc-тест с поправкой на Бонферрони: RW против Sed, P < 0,001; RW против HIT, Р < 0,001; HIT по сравнению с Sed, Р = 0,242). Этот эффект отсутствовал у крыс, получавших LRT (односторонний ANOVA: F2,25 = 1,32, P = 0,285). Таким образом, добровольное бегание на колесах было наиболее эффективным в достижении различий между крысами, получавшими LRT и HRT, в беговой способности (рис. 1D), а также в увеличении AHN (рис. 1F).
Также была оценена взаимосвязь между способностью к бегу и AHN. Сначала мы рассчитали корреляции, не разделяя линии крыс HRT и LRT. Затем каждая линия крыс была проанализирована отдельно. Чтобы избежать каких-либо побочных эффектов, связанных с различиями в сроках окрашивания между линиями крыс, использовали стандартизированный показатель AHN. Не было обнаружено корреляции между максимальной способностью к бегу после тренировки и АН у крыс, подвергшихся удару (линии крыс в совокупности: r = 0,188, P = 0,427, n = 20). Отдельный анализ для каждой линии крыс подтвердил этот результат (HRT-HIT, r = 0,443, P = 0,232, n = 9; LRT-ПОПАДАНИЕ, r = -0,146, P = 0,668, n = 11). Также не было обнаружено корреляции между AHN и изменением (выраженным в процентах) максимальной беговой способности у крыс, подвергшихся воздействию HIT (в совокупности, r = -0,309, P = 0,185, n = 20; HRT-HIT, r = -0,147, P = 0,706, n = 9; LRT-HIT, r = -0,579, P = 0,062, n = 11). Однако была обнаружена значимая положительная корреляция между общим пробегом дистанции во время HIT и AHN (r = 0,538, P = 0,014, n = 20; см. рис. 4А). Более того, эта корреляция была статистически значимой только у крыс, получавших HRT (r = 0,797, P = 0,010, n = 9), но не у крыс, получавших LRT (r = 0,100, P = 0,771, n = 11), когда линии крыс анализировались отдельно (см. рис. 4А). То есть количество форсированных аэробных упражнений предсказывало результат при АН только у крыс, получавших ЗГТ, но не у крыс, получавших ЛЗТ.
Те же анализы, примененные к крысам, подвергнутым произвольному бегу на колесах, показали значимую корреляцию между максимальной способностью к бегу после тренировки и AHN (линии крыс в совокупности, r = 0,649, P = 0,002, n = 20; см. фиг. 4B), но не между изменением (выраженным в процентах) максимальной работоспособности и AHN (r = 0,378, P = 0,100, n = 20). Дальнейшее изучение каждой линии крыс в отдельности не выявило статистически значимых корреляций между максимальной способностью к бегу после тренировки и AHN (HRT-RW, r = 0,504, P = 0,167, n = 9; LRT-RW, r = 0,545, P = 0,083, n = 11; см. фиг. 4B) или между изменением (выраженным в процентах) максимальной работоспособности и AHN (HRT-RW, r = -0,481, P = 0,190, n = 9; LRT-RW, r = 0,371, P = 0,261, n = 11). Мы также рассчитали корреляцию между общей дистанцией бега за 7 недель и AHN. В целом была выявлена значимая корреляция (линии крыс вместе взятые, r = 0,463, P = 0,040, n = 20; см. рис. 4С), но не тогда, когда каждую линию крыс исследовали отдельно (HRT-RW, r = 0,256, P = 0,506, n = 9; LRT-RW, r = 0,219, P = 0,518, n = 11; см. рис. 4С). Таким образом, значимая корреляция между максимальной способностью к бегу и AHN, а также между расстоянием бега и AHN отражает разницу в реакции на тренировку между двумя линиями крыс, HRT и LRT.
Эксперимент 2: у крыс, подвергавшихся тренировкам на выносливость, наблюдалось большее количество AHN по сравнению с крысами, подвергавшимися силовым тренировкам
В следующие анализы были включены только животные с успешными срезами и окрашиванием на даблкортин (окончательные размеры групп указаны ниже). Все животные в этом эксперименте сначала подвергались 8-недельным стандартизированным упражнениям на беговой дорожке в абсолютном объеме для измерения адаптивной реакции на аэробные тренировки (Koch et al., 2013). Перед любой тренировкой животные, получавшие HRT и LRT, могли бегать с сопоставимыми скоростями (односторонний ANOVA: F1,23 = 2,02, P = 0,168). В ответ на 8 недель тренировок на беговой дорожке максимальная скорость бега у крыс с ЗГТ увеличилась больше, чем у крыс с ЛЗТ (см. фиг. 2B; изменение: 15,85 ± 1,35 против 5,43 ± 1,01% соответственно; односторонний дисперсионный анализ: F1,23 = 37,47, P < 0,001).
Затем половину крыс, получавших LRT и HRT, подвергали длительным тренировкам на выносливость на беговой дорожке в течение дополнительных 6 недель, выполняемым на 60% от максимальной скорости бега. Крысы, участвовавшие в HRT, стартовали со скоростью 17 м/мин−1, а крысы, участвовавшие в LRT, − со скоростью 14 м/мин-1 (63,5 ± 1,6 и 58,3 ± 1,4% от максимальной скорости бега соответственно). Скорость увеличивали на 1 м мин−1 каждую неделю, так что в конце тренировки крысы HRT бегали со скоростью 22 м мин−1, а крысы LRT - со скоростью 19 м мин−1. Таким образом, крысы, получавшие HRT, пробежали в общей сложности 8016 ± 276 м (n = 8), в то время как крысы, получавшие LRT, пробежали 6972 ± 258 м (n = 7). То есть крысы с ЗГТ тренировались на более длинных дистанциях, чем крысы с ЛЗТ (односторонний ANOVA: F1,13) = 8,82, P = 0,011). Однако при такой относительной корректировке обе линии крыс смогли завершить тренировочные сессии в эквивалентной степени (HRT, 99 ± 1% против LRT, 95 ± 3%; F1,13 = 3,13, P = 0,100). Тренировка на выносливость привела к схожему улучшению максимальной беговой способности крыс, получавших HRT и LRT (см. рис. 2C; повторные измерения ANOVA: основной эффект от физических упражнений, F1,13 = 22,75, P < 0,001; взаимодействие линии крыс и физических упражнений, F1,13 = 0,07, P = 0,792). В среднем, крысы, получавшие ЗГТ, улучшили свою беговую способность на 18,04 ± 6,33%. Соответствующее увеличение беговой способности у крыс, получавших ЗГТ, составило 17,48 ± 3,43%. В целом, максимальная беговая способность во время тренировки на выносливость была выше у крыс, получавших ЗГТ, по сравнению с крысами, получавшими ЛЗТ (основной эффект крысиной линии, F1,13 = 4,67, P = 0,050). Это общее различие было результатом разницы в относительной скорости бега в начале тренировочного периода (односторонний дисперсионный анализ: F1,13 = 5,37, P = 0,037). Как крысы с HRT, так и крысы с LRT бегали с сопоставимой скоростью во время посттренировочного теста (F1,13 = 1,87, P = 0,195).
Другая половина крыс, которые в течение 6 недель тренировались с отягощениями на вертикальной лестнице, продемонстрировала увеличение силы [измеряемой как максимальная нагрузка (в граммах), которую крыса была способна поднять на вершину лестницы] как в группах LRT, так и в группах HRT крыс (см. фиг. 2D; повторные измерения ANOVA: основной эффект от физических упражнений до и после тренировки: F1,8 = 797,73, P < 0,001). Однако увеличение силы было более заметным у крыс, получавших ЗГТ (n = 5), по сравнению с крысами, получавшими ЛЗТ (n = 5; взаимодействие линии крыс и физических упражнений, F1,8 = 22,99, P = 0,001; основной эффект линии крыс, F1,8 = 8,19, P = 0,021).. Увеличение силы составило в среднем 201 ±13% у крыс, получавших ЗГТ, тогда как у крыс, получавших ЛЗТ, соответствующее изменение составило в среднем 147 ±17%.
Мы также проверили, влияют ли индивидуальные различия в адаптивной реакции на тренировку в течение начального 8-недельного периода абсолютной тренировки на результат во время последующих тренировок на относительную выносливость или сопротивление. Мы не обнаружили корреляции между увеличением максимальной скорости бега (выраженной в процентах) во время начальной абсолютной тренировки и увеличением беговой способности во время продолжающейся тренировки на относительную выносливость (r = -0,044, P = 0,875, n = 15), когда в анализ были включены обе линии крыс. Однако дальнейший анализ, проведенный для каждой линии крыс отдельно, показал значительную корреляцию между изменением (выраженным в процентах) максимальной скорости бега во время начальной тренировки и увеличением (выраженным в процентах) способности к бегу во время последующей тренировки на выносливость у крыс, получавших LRT (r = 0,942, P = 0,002, n = 7), но не у крыс, получавших ЗГТ (r = -0,459, P = 0,252, n = 8). Это говорит о том, что генетические факторы, отобранные для высокой реакции на аэробные упражнения, отличаются от генетических факторов, отобранных для линии с низкой реакцией.
Что касается силовых тренировок, то мы обнаружили значимую положительную корреляцию между реакцией на тренировку в течение начального 8-недельного периода абсолютных тренировок и увеличением силы (выраженным в процентах) во время силовых тренировок (суммарные показатели крыс, r = 0,740, P = 0,014, n = 10). Однако не было обнаружено корреляции между начальной тренировкой и тренировкой с отягощениями, когда каждая линия крыс анализировалась отдельно (HRT, rs = 0,359, P = 0,553, n = 5; LRT, rs = 0,400, P = 0,505, n = 5). Это говорит о том, что, хотя результаты крысы во время аэробной тренировки предсказывают результаты во время силовой тренировки, генетические факторы, отобранные для низкой и высокой реакции на аэробную тренировку, не связаны однозначно с реакцией на силовую тренировку.
Наконец, мы изучили влияние тренировок на выносливость в сравнении с силовыми упражнениями на АН (см. рис. 2E и F). Животные, подвергавшиеся тренировкам на относительную выносливость, имели значительно больше даблкортин-позитивных клеток гиппокампа по сравнению с животными, подвергавшимися силовым тренировкам, независимо от линии крыс (одномерный ANOVA: основной эффект от типа упражнений, F1,21 = 5,72, P = 0,026; взаимодействие типа упражнений и линии крыс, F1,21 = 0,11, P = 0,743; основной эффект крысиной линии, F1,21 = 0,23, P = 0,636). Используя корреляционный анализ, мы не обнаружили связи между максимальной скоростью бега после тренировки на выносливость и количеством новых нейронов (линии крыс вместе взятые, r = 0,156, P = 0,579, n = 15; HRT, r = 0,212, P = 0,614, n = 8; LRT, r = 0,082, P = 0,861, n = 7) или между изменением (выраженным в процентах) максимальной скорости бега вследствие тренировки на выносливость и количеством новых нейронов (линии крыс вместе взятые, r = 0,057, P = 0,840, n = 15; HRT, r = 0,172, P = 0,684, n = 8; LRT, r = -0,334, P = 0,464, n = 7). Хотя относительная тренировка у крыс с LRT и HRT была разной, также не было обнаружено корреляции между общим пробегом дистанции во время тренировки на выносливость и количеством новых нейронов гиппокампа (линии крыс вместе взятые, r = -0,029, P = 0,917, n = 15; HRT, r = -0,123, P = 0,771, n = 8; LRT, r = 0,205, P = 0,659, n = 7). Кроме того, не было обнаружено корреляции между абсолютной силой после тренировки с отягощениями и количеством новых нейронов (r = 0,000, P = 1, n = 10) или изменением (выраженным в процентах) силы и количества новых нейронов (r = 0,304, P = 0,393, n = 10). Отдельные анализы для каждой линии крыс дали сходные результаты (абсолютная сила × нейрогенез: HRT/LRT, rs = 0,600/0,791, P = 0,285/0,111, n = 5/5; и изменение силы × нейрогенез: HRT/LRT, rs = 0,600/0,700, P = 0,285/0,188, n = 5/5). 5/5). Таким образом, тренировки на выносливость улучшили АН по сравнению с силовыми тренировками, независимо от наследственной предрасположенности к низкой или высокой реакции на аэробные нагрузки.
Эксперимент 3. нейрогенез гиппокампа взрослых крыс, подвергнутых силовым тренировкам, не отличался от того, который наблюдался у их малоподвижных собратьев
Восемь недель силовых тренировок у молодых взрослых крыс–самцов Спрэга-Доули увеличили силу на ≈250 ± 8% (см. рис. 3Б; парный t-критерий Стьюдента: t(9) = 58,55, P < 0,001). Обратите внимание, что 10 животных, подвергнутых силовой тренировке, увеличили абсолютную переносимость в той же степени, что и крысы, получавшие ЗГТ, но в гораздо более узких пределах как до, так и после тренировки (см. рис. 3Б). По сравнению с контрольными крысами, которые вели сидячий образ жизни, крысы, подвергавшиеся силовым тренировкам, набирали меньшую массу тела в течение 8-недельного периода тренировок (ANOVA с повторными измерениями: соотношение группы и времени, F1,18 = 10,44, P = 0,005; основной эффект группы, F1,18 = 4,33, P = 0,052; основной эффект времени, F1,18 = 444,26, P < 0,001). Средняя масса тела у крыс, подвергнутых силовой тренировке, увеличилась с 293 ±2 до 386 ± 7 г, тогда как в контрольной группе, которая вела сидячий образ жизни, масса тела увеличилась с 295 ±4 до 421 ± 12 г.
Влияние силовых тренировок на пролиферацию (Ki67), созревание (даблкортин) и выживание (BrdU) новых нейронов гиппокампа взрослого человека представлено на рис. 3C, D и E, соответственно. Анализ количества Ki67-положительных клеток не выявил различий в пролиферации клеток между сидячей и тренированной группами (односторонний ANOVA: F1,18 = 0,12, P = 0,736). То же самое было верно и для числа незрелых даблкортин-позитивных нейронов (F1,18 = 0,71, P = 0,412). Этот результат был подтвержден тем фактом, что между группами также не было различий в количестве BrdU-позитивных клеток гиппокампа (F1,16 = 0,35, P = 0,563), что указывает на отсутствие влияния силовых тренировок на выживаемость новых клеток, появившихся в гиппокампе у взрослых. Обратите внимание, что по одному животному в каждой группе пришлось исключить из BrdU-анализа из-за отсутствия окрашивания. Аналогично тому, что было показано в эксперименте 2, не было обнаружено устойчивой корреляции между изменением силы (выраженной в процентах) и нейрогенезом (Ki67/даблкортин/BrdU: r = -0.262/-0.036/-0.253, P = 0.465/0.922/0.512, n = 10/10/9). В результате очень небольшого изменения абсолютной силы после тренировки (см. рис. 3B), корреляции между ним и нейрогенезом не были рассчитаны. Подводя итог, по сравнению с контрольными животными, которые вели сидячий образ жизни, 8 недель анаэробных упражнений с отягощениями на вертикальной лестнице не оказали влияния на АН у молодых взрослых самцов крыс Спрага–Доули.
Обсуждение
Нейрогенез в гиппокампе взрослого человека - это непрерывный процесс, который способствует различным формам адаптивного поведения, таким как обучение (обзор см. в Aimone et al., 2014). Хорошо зарекомендовавшим себя средством повышения AHN у грызунов являются аэробные упражнения, а именно бег (van Praag et al., 1999). Здесь мы исследовали, сопоставимы ли эффекты тренировок с ударами или сопротивлением с аэробными упражнениями для повышения AHN у самцов крыс. В соответствии с предыдущей работой, наши исследования показали, что количество нейронов гиппокампа взрослого человека было выше у животных, подвергавшихся длительным аэробным нагрузкам, а именно произвольному бегу на колесах или беговой дорожке на выносливость, по сравнению с контрольными животными, ведущими сидячий образ жизни. Вопреки предыдущим выводам (Novaes Gomes et al., 2014), тренировка с отягощениями не способствовала развитию АН по сравнению с контрольными животными, ведущими сидячий образ жизни, в то время как HIT оказал меньшее, чем ожидалось, влияние на АН, которое не достигло статистической значимости. Наша разработка модельной системы на крысах для определения низкой (LRT) и высокой (HRT) реакции на аэробные упражнения (Koch et al., 2013) также предоставила нам возможность изучить, связана ли генетическая предрасположенность к адаптивной способности к аэробной тренировке с благотворным воздействием физических упражнений на АН. Наши данные свидетельствуют о самом высоком количестве нейронов гиппокампа взрослого человека у крыс, селективно выведенных для получения высокой реакции на аэробные упражнения, которые добровольно выполнялись на беговых колесах. Таким образом, AHN является самым высоким у животных, рожденных с тенденцией к более высокой реакции на физические нагрузки и выполняющих большое количество произвольных аэробных упражнений.Модель крыс с низкой и высокой реакцией на тренировки
В эксперименте 1, обобщенном на рис. 1, мы обнаружили, что при неограниченном доступе к произвольным упражнениям на колесах крысы, получавшие HRT, увеличивали дистанцию бега и улучшали скорость бега в большей степени, чем крысы, получавшие LRT. Соответственно, количество AHN было значительно выше у крыс, получавших ЗГТ, по сравнению с крысами, получавшими ЛЗТ. Это было ожидаемо, учитывая различия в реакции на аэробные упражнения у двух линий крыс (Koch et al., 2013). Крысы, получавшие LRT и HRT, не отличались по своей способности выполнять тренировку HIT или по влиянию HIT на АН. Эксперимент 2 (см. рис. 2). 2) показывает, что после 8 недель тренировок на выносливость на беговой дорожке с использованием стандартного аэробного протокола с абсолютным увеличением скорости крысы, получавшие HRT, приобретают значительно большую способность к физической нагрузке по сравнению с крысами, получавшими LRT. Кроме того, при тренировке с отягощениями с нагрузкой 50-90% от максимальной, выполняемой 3 дня в неделю в течение 6 недель, крысы, получавшие ЗГТ, набирали значительно больше силы, чем крысы, получавшие ЛЗТ. Интересно, что эквивалентное увеличение максимальной беговой способности у обеих линий крыс наблюдалось в ответ на относительную тренировку на выносливость на беговой дорожке, выполняемую со скоростью ≈60% от максимальной беговой способности и проводимую после начального 8-недельного периода тренировок. Это говорит о том, что животные с изначально низкой реакцией на тренировку способны улучшить свои показатели, если аэробные тренировки продолжаются в течение длительного периода времени и соответствуют их уровню производительности. При такой системе тренировок у крыс, подвергавшихся длительным тренировкам на выносливость, наблюдалось большее количество AHN по сравнению с теми, у кого они были. те, кто занимается силовыми тренировками. Таким образом, мы продемонстрировали, что модельная система HRT-LRT на крысах обеспечивает уникальную основу для изучения физиологических и молекулярных связей между изменениями реакции на физические нагрузки и АН.
Высокоинтенсивные интервальные тренировки оказали меньшее, чем ожидалось, влияние на АН
Насколько нам известно, наше исследование является первым, в котором рассматривается вопрос о том, влияет ли упражнение, набирающее популярность среди людей, а именно HIT (см., например, Gibala et al., 2012), на АН. Хотя в некоторых случаях показано, что HIT лучше улучшает сердечно-сосудистую систему, чем умеренные тренировки на выносливость (Haram et al., 2009; Afzalpour et al., 2015), в настоящем исследовании влияние HIT на АН было меньшим, чем ожидалось. Несмотря на то, что HIT улучшал способность к бегу как у крыс, получавших LRT, так и HRT, он не влиял на AHN в статистически значимой степени, хотя на фиг. 1E свидетельствует о тенденции к увеличению числа новых нейронов как у крыс, получающих LRT, так и HRT. Это несколько удивительно, учитывая, что в эксперименте 2 мы действительно обнаружили повышение AHN у животных, подвергавшихся тренировкам на выносливость на беговой дорожке, по сравнению с тем, что наблюдалось у животных, подвергавшихся анаэробным тренировкам с отягощениями (пожалуйста, смотрите следующий раздел). Возможно, если бы мы проводили более длительные тренировки во время HIT, мы бы также наблюдали более значительные улучшения в AHN. Например, Haram и др. (2009) в своем исследовании использовали 60-минутные сеансы HIT и 2-часовые сеансы непрерывного бега на беговой дорожке, сообщив о большей пользе HIT по сравнению с непрерывными физическими упражнениями в снижении ряда факторов сердечно-сосудистого риска.
Наши нынешние результаты о (отсутствии) влияния HIT на АН согласуются с недавним сообщением о значительном улучшении АН в плане созревания новых нейронов в ответ на 6 недель (60 мин в день−1, 5 дней в неделю) легкой (скорость 15 мин−1), а не интенсивной терапии. более интенсивный (40 м мин−1) форсированный бег на беговой дорожке у взрослых крыс-самцов линии Вистар (Inoue et al., 2015). Иноуэ и его коллеги (2015) предполагают, что их результаты могут быть объяснены различиями между двумя видами физических упражнений в активации определенных генов, связанных с метаболизмом липидов, синтезом белка и воспалением в гиппокампе, а также более высоким уровнем стресса, вызванного интенсивными физическими упражнениями по сравнению с умеренными физическими нагрузками. В недавнем исследовании та же группа изучала влияние умеренного (15 мин−1) и интенсивный (30 мин−1) бег на беговой дорожке (30 мин в день−1, 5 дней в неделю) у взрослых мышей-самцов C57BL/6J и обнаружили повышенные концентрации кортикостерона в плазме крови в группе интенсивных тренировок по сравнению с контрольной группой, которая вела сидячий образ жизни (Okamoto et al., 2015). Что еще более важно, та же группа сообщает о наблюдениях усиления транскрипции BDNF в гиппокампе (Soya et al., 2007) и AHN (Okamoto et al., 2015) в ответ только на умеренные, но не интенсивные физические нагрузки. Интересно, что блокирование функции минералокортикоидных и глюкокортикоидных рецепторов, по-видимому, ослабляет повышение АД, вызванное умеренной физической нагрузкой, что позволяет предположить, что для поддержания повышения АД необходим определенный уровень кортикостерона (Okamoto et al., 2015). Это согласуется с наблюдением об усилении АН в ответ на долгосрочный предсказуемый умеренный стресс (Parihar et al., 2011).
Исходя из приведенного выше обсуждения, стресс, возможно, ослабил влияние принудительных тренировок на беговой дорожке, особенно HIT, на АН в нашем исследовании (недавний обзор см. в Lucassen et al., 2015). Фактически, количество клеток, положительных на даблкортин, в наших настоящих экспериментах в целом было относительно низким по сравнению с другими сообщениями о нейрогенезе у взрослых крыс с использованием тех же первичных антител и протокола подсчета (см., например, Winocur et al., 2014). Подводя итог, можно сказать, что длительные (умеренные) аэробные нагрузки, а не HIT, повышают АН у крыс, получающих ЗГТ и ЛЗТ, и роль стресса требует дальнейшего изучения.
Тренировка с отягощениями не способствует развитию АН
Наши результаты, полученные с использованием линий крыс LRT и HRT, а также результаты тестирования имеющихся в продаже крыс Sprague–Dawley, противоречат предыдущему открытию (Novaes Gomes et al., 2014), указывающему на то, что силовые тренировки способствуют развитию АН. Наши текущие данные показывают, что силовые тренировки не влияют на пролиферацию, созревание нейронов или выживание новых клеток, родившихся во взрослом возрасте, в гиппокампе, хотя увеличение силы очевидно. Это прямо противоречит результатам недавнего исследования, в котором сообщалось о большем количестве пролиферирующих клеток в гиппокампе самцов крыс линии Вистар, подвергнутых 4-недельным силовым тренировкам по схеме, аналогичной той, которая использовалась в нашем настоящем исследовании (Novaes Gomes et al., 2014). Возможно, что эффекты силовых тренировок носят временный характер, возможно, они усиливают пролиферацию клеток только в начале тренировки. Это может объяснить, почему в нашем настоящем исследовании не было выявлено никаких эффектов, когда оценивали нейрогенез после 6 (эксперимент 2) или 8 недель (эксперимент 3) тренировок. Обратите внимание, что в наших настоящих экспериментах мы не использовали никаких внешних мотиваторов, чтобы побудить крыс выполнять силовые тренировки. Таким образом, маловероятно, что стресс сам по себе может объяснить, почему мы не наблюдали увеличения AHN в ответ на силовые тренировки (недавний обзор см. в Lucassen et al., 2015). Это особенно относится к эксперименту 2, где проводились сравнения между крысами, тренировавшимися на беговой дорожке (с толчками), и крысами, тренировавшимися на вертикальной лестнице (без толчков). На самом деле, возможно, что умеренный стресс во время принудительных тренировок на беговой дорожке способствовал увеличению AHN (Parihar et al., 2011). Роль стресса следует дополнительно изучить в будущих экспериментах подобного рода.
Наши результаты о влиянии силовых тренировок на АН согласуются с ранее опубликованными данными о влиянии анаэробных упражнений на факторы роста нервной системы, а также могут быть частично объяснены ими. Силовые тренировки на вертикальной лестнице пять раз в неделю (восемь подъемов за сеанс) не увеличивали экспрессию BDNF в гиппокампе по сравнению с контрольными животными, которые вели сидячий образ жизни, как было измерено после 8 недель тренировок (Cassilhas et al., 2012a). Как оказалось, BDNF играет решающую роль в регуляции AHN (Sairanen et al., 2005; Scharfman et al. 2005), и нормальная функция BDNF, по-видимому, является необходимым условием для увеличения AHN, вызванного физической нагрузкой (Li et al., 2008). В нашем настоящем исследовании (эксперимент 2) 30-минутные форсированные аэробные тренировки на выносливость на беговой дорожке три раза в неделю приводили к увеличению количества новых незрелых нейронов гиппокампа по сравнению с тем, что наблюдалось у животных, занимавшихся силовыми тренировками по тому же графику. Таким образом, кажется, что аэробные упражнения более эффективны для постоянного повышения АД, чем анаэробные, по крайней мере, при длительном выполнении.
В целом, в соответствии с предыдущими данными, наши результаты показывают, что для максимального повышения AHN физические упражнения должны быть аэробными и продолжительными. Предыдущие исследования, рассмотренные выше, также свидетельствуют о том, что вызванное физическими нагрузками повышение AHN зависит от усиления функции BDNF. В будущем, чтобы уточнить влияние физических нагрузок на АН, необходимо провести сопоставимые исследования зависимости дозы от режима тренировок.
Продолжительность бега коррелирует с АН
В соответствии с несколькими предыдущими отчетами о благотворном влиянии бега на АН и когнитивные способности у грызунов (обзор см. в Vivar et al., 2013), в нашем настоящем исследовании принудительные тренировки на выносливость на беговой дорожке, а также добровольный бег на беговом круге привели к увеличению числа незрелых новорожденных. нейроны гиппокампа по сравнению с теми, что наблюдались у животных, не занимавшихся аэробными упражнениями. Кроме того, мы обнаружили, что ежедневный добровольный бег на беговом колесе значительно увеличивает АН, по сравнению с 30-минутными тренировками на выносливость на беговой дорожке три раза в неделю. Это неудивительно, учитывая положительную корреляцию между бегом на длинные дистанции и AHN (Allen et al., 2001), связь, которая также очевидна в наших текущих данных (эксперимент 1; см. рис. 4). Обратите внимание, что бег на беговой дорожке с постоянной скоростью 40 м/мин−1 (максимальная скорость для некоторых лучших бегунов в наших экспериментах) в течение 30 мин составляет 1200 м, в то время как животные обычно пробегают несколько километров в день, если им предоставляется свободный доступ к беговому колесу. Подводя итог, можно сказать, что количество аэробных упражнений может иметь решающее значение для их влияния на АН.
Взаимосвязь между дистанцией бега и AHN можно объяснить, рассмотрев последствия бега (в более реалистичной обстановке). Чем дальше человек продвигается, тем больше вероятность того, что он столкнется с новыми условиями и стимулами, из которых он должен быстро извлечь смысл. Возможно, сам по себе процесс бега, даже если он выполняется на колесе или беговой дорожке, побуждает мозг реагировать на изменения во внешней среде, например, увеличивая AHN. Это предположение подтверждается результатами, указывающими на то, что новые нейроны гиппокампа особенно важны для обучения (Shors et al. 2001) и разделение паттернов (Clelland et al., 2009), причем животные хуже справляются с этими задачами, если нарушается AHN.
Следует также отметить, что положительное влияние длительных аэробных упражнений на нейрогенез взрослых не ограничивается только гиппокампом, поскольку сообщалось также об усилении нейрогенеза у взрослых в субвентрикулярной зоне (Bednarczyk et al., 2009; Chae et al., 2014) и в гипоталамусе (Niwa et al., 2015).. Это анатомически распространенное усиление нейрогенеза у взрослых в ответ на длительные аэробные нагрузки позволяет предположить, что в дополнение к механизмам, локальным для гиппокампа, таким как усиление андрогенной функции (Okamoto et al. 2012), для поддержания АН должен существовать общий медиатор, наиболее очевидным кандидатом на который является усиление кровотока. Большая часть пролиферирующих клеток гиппокампа расположена вблизи мелких капилляров (Palmer et al., 2000). Кроме того, аэробные упражнения увеличивают кровоток, особенно в зубчатой извилине, как у людей, так и у мышей (Pereira et al., 2007). Это увеличение кровотока, вероятно, увеличивает как метаболическую, так и трофическую поддержку нейрогенной ниши. Фактически, предыдущие исследования гиппокампа показали, что у грызунов дистанция бега также положительно коррелирует с экспрессией BDNF (см., например, Johnson et al., 2003), а анаэробные упражнения не способствуют повышению уровня BDNF (Cassilhas et al., 2012a; см. также Soya et al., 2007). Кроме того, экспрессия и функция BDNF также повышаются за счет повышенной активности нейронов (недавний обзор см. в Rothman & Mattson, 2013). Что касается связанного с этим вопроса, то влияние обучения на выживаемость новых нейронов гиппокампа взрослого человека (Gould et al., 1999), по-видимому, зависит от объема обучения; как правило, чем больше усилий требует изучение определенной задачи и, предположительно, чем дольше гиппокамп участвует в процессе обучения, тем больше новых нейронов гиппокампа выживают в ответ на обучение (обзор см. в Shors et al., 2012; см. также Sisti et al., 2007).
В совокупности, кажется, что тренировки (как когнитивные, так и физические) должны быть продолжительными, чтобы способствовать развитию АН наиболее эффективно. Однако, фундаментальный биологический механизм, лежащий в основе того, как физические упражнения повышают АН, является спорным. Точные регуляторные механизмы, посредством которых взаимодействуют варианты генов и результаты физических упражнений, неизвестны, но, вероятно, они включают сети взаимодействий генов-модификаторов, которые связывают увеличение кровотока, сигнальные пути, активность нейронов и нейротрофическое действие.
Ограничения
Некоторые ограничения нашего настоящего исследования требуют дальнейшего обсуждения. Во-первых, мы проводили исследования исключительно на взрослых крысах-самцах. Однако, поскольку предыдущие исследования у самок (van Praag et al., 1999; Marlatt et al., 2012) и у пожилых животных (van Praag et al., 2005) показали усиление как АН, так и когнитивных функций в ответ на бег, можно предположить, что наши результаты применимы к обоим полам и к пожилым грызунам и еще. Наше решение тестировать только самцов было прямым результатом высокой нагрузки, необходимой для проведения исследований по физической подготовке животных, и нашей заинтересованности в проведении аналогичного исследования для AHN в ответ на силовые тренировки, которые, как сообщается, проводились на взрослых крысах-самцах. Таким образом, в будущих исследованиях было бы предпочтительнее тестировать животных обоих полов и разного возраста. Во-вторых, с точки зрения межвидовой применимости, в нескольких исследованиях сообщалось о большем объеме гиппокампа и лучших когнитивных способностях у физически активных/ подтянутых пожилых людей (Erickson et al., 2009; Erickson et al., 2011; Варма и др., 2015). В недавнем исследовании, проведенном на мышах, объем серого вещества гиппокампа показал наиболее сильную корреляцию с количеством даблкортин-позитивных клеток гиппокампа (Biedermann et al., 2014), что позволяет предположить, что увеличение объема гиппокампа может быть, по большей части, результатом усиления АН. Предварительно можно предположить, что физические упражнения влияют на структуру и функции гиппокампа у людей аналогично тому, что наблюдается у лабораторных грызунов (см. также Hauser et al., 2009). В-третьих, хотя в наших настоящих экспериментах мы непосредственно не измеряли мотивацию к занятиям спортом, не следует упускать из виду ее роль в опосредовании благотворного воздействия физической активности на мозг. Что касается принудительных тренировок и тестирования максимальной работоспособности, мы не наблюдали никакой разницы между линиями крыс HRT и LRT в их мотивационном поведении на беговой дорожке или вертикальной лестнице.